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細胞生物學應該用什么顯微鏡？

來源：技術文章更新時間：2022-07-22 瀏覽：1996次

細胞生物學概念

細胞生物學是以細胞為研究對象，從細胞的顯微水平、亞顯微水平和分子水平三個層次，研究細胞結構、功能和生活史。顯微結構一般是指大概輪廓，大的結構，如線粒體，葉綠體，細胞核等，其分辨力大于0.2微米，可在光學顯微鏡下觀察；亞顯微結構是更具體的結構，如細胞膜，核膜，內質網膜等，其分辨力小于0.2微米，受制于光學顯微鏡的衍射極限，需用電子顯微鏡才能夠分辨，但電子顯微鏡不適用于活細胞成像，很多應用研究也只需確定該亞顯微物質的分布而無需明確具體結構，因此通常可通過熒光標記等方式使用寬場熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡等進行研究。

明美顯微鏡相機MC50-S下的細胞成像

顯微成像技術在細

胞生物學中的應用

細胞生物學主要對細胞的生命活動進行研究，包括生長、發(fā)育、繁殖、遺傳、變異、衰老、死亡、代謝、調控、分化等，使用光學顯微鏡可以進行的研究內容有以下幾種：①生物膜與細胞器；②細胞信號轉導；③細胞骨架體系；④細胞核、染色體及基因表達；⑤細胞增殖及其調控；⑥細胞分化及干細胞；⑦細胞死亡；⑧細胞衰老；⑨細胞工程。

這些研究都基于對細胞顯微水平及亞顯微水平的觀測：

（1）研究細胞顯微層面的形態(tài)、活動，如細胞遷移、胞吞、細胞的纖毛和鞭毛運動等

細胞一般呈透明狀，未經染色的標本或活細胞，適用于相差觀察，如活細胞培養(yǎng)（劃痕實驗、遷移實驗）

（2）細胞亞顯微水平的染色及熒光標記觀測

細胞亞顯微結構大小一般小于0.2微米，使用光學顯微鏡無法觀測其具體結構，但可利用其結構中的蛋白質或核酸等物質，選擇合適的熒光染料與其結合，通過熒光顯微鏡觀測熒光信號從而判斷該物質的分布和活動。

MF53-N下的細胞有絲分裂

顯微成像技術在細胞

生物學應用中的挑戰(zhàn)

細胞生物學成像有以下幾個難點需要注意：

1）細胞的長時間活性和健康度需要培養(yǎng)條件支持。細胞的活性和健康度需要合適的溫度、濕度和氣體培養(yǎng)條件支持，離開了這些條件細胞無法長時間保持活性。如果觀察和實驗可以短時間完成，那么離開培養(yǎng)條件后盡快完成觀察和實驗即可。對于需要長時間觀察的細胞活動，則需要考慮把成像設備放到培養(yǎng)箱里，或者把培養(yǎng)皿放到成像設備上然后使用微流控細胞芯片分析儀等調節(jié)、保持培養(yǎng)條件。

（MF53-N+MSX2拍攝的細胞劃痕實驗狀態(tài)）

2）不合適的光源可能損傷細胞活性和健康度。高能量的激發(fā)光（如汞燈的紫外線）、高強度的光照（如共聚焦的激光光源）、長時間照射，會影響細胞的活率和健康度，這在傳統汞燈光源中比較明顯。使用LED冷光源的寬場熒光顯微鏡，做無需染色的相襯或者霍夫曼調制相襯觀察，是光源性損傷更低的方案，需要熒光染色時使用低光毒性的的長波段熒光染料（如cy5、cy5.5、cy7等），搭配盡可能低的光強和盡可能短的激發(fā)/成像時間，也是一種思路。

低光毒性的LED光源相襯觀察

3）熒光染料可能損傷細胞健康。熒光染料的毒性和激發(fā)光的光毒性會使細胞健康處于不良的狀態(tài)，典型的是DAPI和Hoechst，這些染料有一定的毒性，并且使用有光毒性的紫外光激發(fā)，對于這種情況，建議在染色后盡快實驗，并盡量縮短實驗時間。

4）不合適的熒光染料搭配會導致成像不理想。熒光染料不合適或過多，會導致光譜重疊、非特異性染色，背景信號會增強，影響熒光成像效果。為了避免這種問題，需要合理選擇染料的種類和數量，盡量錯開發(fā)射波段，并針對染料選擇合適的濾光片，通常使用窄帶發(fā)射濾光片會有更好的效果。另外還可通過加入適量背景抑制劑減少背景熒光。

5）熒光成像考驗相機的靈敏度。熒光成像屬于弱光成像，普通顯微鏡相機可能會出現成像時間長、背景噪聲高的問題，拍攝的圖片容易糊掉。使用高靈敏度的相機，可以降低成像時間，減少光毒性影響，并減少背景噪聲，這對于紫外成像和紅外成像來說更加明顯。對于650nm以上的紅外波段成像，還需要用到去除了藍玻璃/IRCF的sCMOS科研級相機（黑白）。

6）焦面漂移，觀察目標可能會在實驗過程中因移動而失焦。具有自動聚焦功能的活細胞成像儀，可以幫助您保持更長的目標聚焦時間并減少焦點漂移。另外，將細胞培養(yǎng)在恒定溫度并保持容器中溶液的體積恒定也有助于解決聚焦漂移問題

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